aatbio基于細(xì)胞的鈣通量測(cè)定法廣泛用于高通量篩選（HTS）中，以通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），大量完整的膜蛋白家族和藥物中的重要靶點(diǎn)類別確定激動(dòng)劑刺激和拮抗劑抑制的信號(hào)傳導(dǎo)發(fā)現(xiàn)。準(zhǔn)確測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣的濃度和動(dòng)員可以更全面地了解鈣調(diào)節(jié)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，細(xì)胞功能和病理過(guò)程。

AAT Bioquest已開(kāi)發(fā)的鈣指標(biāo)，包括大的集合的Fluo-8 ^®，卡爾-520 ^®，和Calbryte™鈣指標(biāo)，以及，鈣流測(cè)定法來(lái)跟蹤動(dòng)員激烈的熒光信號(hào)和在各種波長(zhǎng)選擇鈣從紫外線到紅外線。

aatbio鈣：通用信使

鈣是一種普遍存在的信使，會(huì)影響許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括鈣誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)確認(rèn)變化，細(xì)胞溶質(zhì)和細(xì)胞器鈣水平的調(diào)節(jié)，鈣介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的高度局限性及其在興奮性，胞吐作用，運(yùn)動(dòng)性中的特定作用。 ，凋亡和轉(zhuǎn)錄。這些途徑調(diào)節(jié)許多關(guān)鍵的細(xì)胞過(guò)程，包括神經(jīng)傳遞，細(xì)胞增殖和肌肉收縮。在正常條件下，相對(duì)于細(xì)胞外液，鈣的靜息細(xì)胞質(zhì)濃度相對(duì)較低（約100 nM）。鈣信號(hào)傳導(dǎo)是通過(guò)從細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存物中釋放鈣離子，或通過(guò)質(zhì)膜離子通道流入細(xì)胞外鈣而激活的。受刺激的細(xì)胞可將細(xì)胞質(zhì)鈣濃度增加至500至1000 nM。

定量胞漿鈣

顯示結(jié)合鈣后光譜響應(yīng)的熒光指示劑使研究人員能夠通過(guò)使用熒光顯微鏡，流式細(xì)胞儀，熒光光譜和熒光酶標(biāo)儀來(lái)研究細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度的變化。為了便于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員并促進(jìn)被動(dòng)擴(kuò)散，將乙酰氧基甲基酯（AM酯）官能團(tuán)連接到鈣指示劑的核心結(jié)構(gòu)上。這增加了指示劑的疏水性，使其易于穿透完整的質(zhì)膜，并通過(guò)小化非特異性背景熒光來(lái)增強(qiáng)指示劑靈敏度，因?yàn)锳M酯偶聯(lián)的指示劑基本上是無(wú)熒光且無(wú)活性的。

一旦探針進(jìn)入活細(xì)胞，并且僅在細(xì)胞內(nèi)酯酶除去AM酯官能團(tuán)后，才開(kāi)始活性。激活后，探針會(huì)通過(guò)螯合檢測(cè)鈣，并通過(guò)生成相對(duì)于鈣濃度的熒光信號(hào)作出響應(yīng)。指標(biāo)如FLUO-8 ^®，AM（目錄號(hào)21080），加州-520 ^®，AM（目錄號(hào)21131）和Calbryte ^™  520，AM（目錄號(hào)20653）進(jìn)行了廣泛的鈣成像中使用，鈣通量分析以及用于藥物發(fā)現(xiàn)的基于細(xì)胞的高通量篩選（HTS）分析。鈣指示劑與流式細(xì)胞儀，熒光顯微鏡和熒光微孔板平臺(tái)兼容。除了提供熒光和發(fā)光鈣指示劑外，我們還提供了幾種非熒光鈣信號(hào)分子和螯合劑，用于測(cè)量和操縱細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外鈣。

單波長(zhǎng)鈣指示劑

單波長(zhǎng)鈣指示劑被廣泛用于監(jiān)測(cè)鈣動(dòng)員，對(duì)鈣信號(hào)的空間動(dòng)態(tài)進(jìn)行成像，以及在基于HTS細(xì)胞的藥理學(xué)篩選中，通過(guò)GPCR來(lái)分析激動(dòng)劑刺激和拮抗劑抑制的信號(hào)。這些指示劑在飽和鈣水平下顯示出顯著的鈣依賴性熒光強(qiáng)度變化，而不會(huì)改變其吸收或發(fā)射波長(zhǎng)。我們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種鈣指標(biāo)，包括FLUO-8 ^®，加州-520 ^®和Calbryte™系列，以動(dòng)員跟蹤鈣與亮的熒光信號(hào)和各種波長(zhǎng)和親和力的選擇，以滿足多種應(yīng)用。

單波長(zhǎng)指示器的好處

• 靜息鈣水平下背景熒光小
• 改善的信噪比
• 大大提高了細(xì)胞保留
• 活細(xì)胞鈣分析的細(xì)胞滲透形式（與成像，流式細(xì)胞儀和微孔板檢測(cè)（例如HTS）兼容）
• 細(xì)胞不滲透形式，可通過(guò)微量注射，貼片移液器或松果體上樣進(jìn)行上樣
• 紫外線（UV），紫色和可見(jiàn)光激發(fā)格式
• 低，中和高親和力格式可提供滿足許多應(yīng)用的靈敏度范圍

圖1.在CHO-K1細(xì)胞中測(cè)得的ATP反應(yīng)。加入含丙磺舒的HH緩沖液中的100 µL 10 µg / ml Calbryte™520 AM（Cat No. 20653）或含丙磺舒的HH Buffer中的10μg/ ml Fluo-4，AM（Cat No. 20550），并孵育45分鐘在37°C下。然后除去染料加載溶液，并用200 µL HH Buffer /孔替換。加入ATP（50 µL /孔）以達(dá)到指示的10 µM濃度，然后用顯微鏡FITC通道（Keyence）成像。

表1的Fluo-3的光譜進(jìn)行比較，的Fluo-4，的Fluo-8 ^®，加州-520 ^®和Calbryte™520個(gè)綠色熒光鈣指標(biāo)。

1. K _d：鈣解離常數(shù)。
2. Φ：在5 mM檸檬酸鈣存在下的熒光量子產(chǎn)率。
3. F _Ca / F _Free：相對(duì)于無(wú)鈣指示劑形式，鈣結(jié)合指示劑的熒光強(qiáng)度增加。

表2. Rhod-2，Rhod-4™，Rhod-5N和Rhod-FF橙/紅熒光鈣指示劑的光譜比較。

1. K _d：鈣解離常數(shù)。

比例鈣指標(biāo)

與單波長(zhǎng)指示器相比，比率式（或雙波長(zhǎng)）指示器具有*的光譜特性，這些光譜特性是響應(yīng)鈣離子結(jié)合而觸發(fā)的。當(dāng)與鈣結(jié)合時(shí)，比例指示劑的佳吸收率或發(fā)射波長(zhǎng)強(qiáng)度都會(huì)發(fā)生變化。例如，雙重激發(fā)鈣指示劑Fura-2，AM和Fura-8™，AM在結(jié)合或不含鈣時(shí)均顯示兩個(gè)峰值激發(fā)波長(zhǎng)。當(dāng)分別在結(jié)合鈣的和無(wú)鈣的峰值激發(fā)波長(zhǎng)下激發(fā)時(shí)，鈣濃度的增加會(huì)引發(fā)雙激發(fā)指示劑的熒光發(fā)射強(qiáng)度的增加和減少。

比例指標(biāo)的好處

• 比例測(cè)定可準(zhǔn)確測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣濃度
• 小化不均勻染料加載，染料滲漏，光漂白和變化的細(xì)胞厚度（在混合種群中常見(jiàn)）的影響
• 提供更可靠和可重復(fù)的結(jié)果
• 雙重激勵(lì)或雙重排放格式的指示器
• 活細(xì)胞鈣分析的細(xì)胞滲透形式（與成像，流式細(xì)胞儀和微孔板檢測(cè)（例如HTS）兼容）
• 細(xì)胞不滲透形式，可通過(guò)微量注射，貼片移液器或松果體上樣進(jìn)行上樣
  • 選擇不滲透細(xì)胞的比例指示器。

圖2.在用的Fura-2 AM（目錄號(hào)測(cè)量CHO-K1細(xì)胞的ATP劑量響應(yīng)21023）和的Fura-8™AM（目錄號(hào)21056）。將CHO-K1細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/ 100 µL /孔在黑壁/透明底部96孔板中過(guò)夜接種，然后與Fura-2 AM或Fura-8 AM鈣測(cè)定染料上樣溶液孵育1小時(shí)。ATP劑量由Flexstation添加。

比例鈣指示劑指南

下表列出了細(xì)胞滲透性鈣比率指示劑的規(guī)格，其吸收和發(fā)射大值以及鈣解離常數(shù)。還可以使用每種比例指示劑的不滲透細(xì)胞的鉀鹽和鈉鹽衍生物。

Calbryte™鈣指示劑

該Calbryte™系列是為監(jiān)測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣動(dòng)員亮和強(qiáng)大的鈣指標(biāo)的家庭。它包括三種新穎的鈣指示劑，Calbryte™520，Calbryte™590和Calbryte™630，它們的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)主要不同。Calbryte™探針以顯著更高的信號(hào)本底特性發(fā)射熒光信號(hào)，并大大增強(qiáng)了細(xì)胞保留能力。Calbryte™系列已經(jīng)過(guò)優(yōu)化，可用于熒光顯微鏡，熒光酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞儀。它們還可以用于高通量篩選應(yīng)用。

Calbryte™系列的優(yōu)點(diǎn)

• 在相同條件下，Calbryte™探針比任何其他鈣指示劑都明顯更亮
• 大大提高了信噪比
• 增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)保留，消除了丙磺舒的使用
• 45至60分鐘內(nèi)即可快速方便地裝載細(xì)胞
• 均質(zhì)胞質(zhì)定位
• 紅移的Calbryte™590和Calbryte™630可與GFP或其他綠色熒光染料一起使用以進(jìn)行多路復(fù)用

圖3.在使用CHO-K1細(xì)胞中內(nèi)源性P2Y受體ATP的熒光信號(hào)響應(yīng)的比較屏幕任務(wù)™Calbryte™520鈣測(cè)定試劑盒，F(xiàn)LIPR ^®鈣4分析（Molecular Devices）中，和的Fluo-4的直接™鈣離子測(cè)定（分子探針^®）。將CHO-K1細(xì)胞以50,000個(gè)細(xì)胞/ 100 µL /孔在96孔黑壁/透明底部肋骨板上接種過(guò)夜。鈣通量響應(yīng)分別用所有三種測(cè)定法測(cè)量。FlexStation 3添加了ATP（50 µL /孔）以達(dá)到指示的濃度。

Calbryte™系列鈣指示劑指南

下表列出了Calbryte™鈣指示劑的規(guī)格，其吸光度和發(fā)射大值以及鈣解離常數(shù)。還可以使用Calbryte™鈣指示劑的其他包裝規(guī)格

1. 滲透性： AM酯鈣指示劑具有細(xì)胞滲透性，可以被動(dòng)加載到活細(xì)胞中（加載到細(xì)胞培養(yǎng)基中）。K ⁺鹽，Na ⁺鹽和NH ₄ ⁺鹽鈣指示劑是不滲透細(xì)胞的，可通過(guò)微量注射，貼片移液管或松果體細(xì)胞加載。

CAL-520 ^®鈣指標(biāo)

在CAL-520 ^®系列是熒光鈣敏感染料的全面的產(chǎn)品組合。它包括六個(gè)指標(biāo)，加州-500™，加州-520 ^®，加州-590™，加州-630™，加州-670™和CAL-770™，它主要是在它們的吸收和發(fā)射波長(zhǎng)不同。每種校準(zhǔn)染料在鈣的靜置水平下發(fā)出的熒光極少，在飽和鈣濃度下其熒光強(qiáng)度增加> 100倍。Cal染料可以以細(xì)胞可滲透的AM酯形式以及不滲透細(xì)胞的鉀鹽，鈉鹽和葡聚糖結(jié)合物形式提供。

在CAL-520的優(yōu)點(diǎn)^®系列

• 比Fluo-3，F(xiàn)luo-4，Rhod-2和Rhod-5更高的信噪比
• 增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)保留
• 方便高效的細(xì)胞加載
• 均質(zhì)胞質(zhì)定位
• 紅移的Cal-590™，Cal-630™，Cal-670™和Cal-770™可與GFP或其他綠色熒光染料一起使用，以進(jìn)行多路復(fù)用
• Cal-770™可用于體內(nèi)研究
• CAL-520 ^®，CAL-590™，CAL-630™，在可供™CAL-670™和CAL-770 3000兆瓦和10000種兆瓦葡聚糖綴合物格式

圖4.用Cal-520™AM（目錄號(hào)）或Fluo-4 AM（目錄號(hào)）孵育的CHO-K1細(xì)胞中ATP刺激的內(nèi)源P2Y受體鈣反應(yīng)。將CHO-K1細(xì)胞以每100 µL每孔50,000個(gè)細(xì)胞的接種量在Costar黑墻/透明底部96孔板中過(guò)夜。將HHBS中的100 µL 5 µM Fluo-4 AM或Cal 520™AM（不含丙磺舒）加到樣品中，并在37°C下孵育1小時(shí)。使用FlexSation添加ATP（50 µL /孔）以達(dá)到指示的濃度。

CAL-520 ^®系列鈣指示劑導(dǎo)向

下表列出了規(guī)格為校準(zhǔn)-520 ^®鈣指示劑系列，它們的吸收率和發(fā)射大值，和它們的鈣離解常數(shù)。在CAL-520的其他包裝規(guī)格^®鈣指示劑系列可供選擇，

1. 滲透性： AM酯鈣指示劑具有細(xì)胞滲透性，可以被動(dòng)加載到活細(xì)胞中（加載到細(xì)胞培養(yǎng)基中）。K ⁺鹽，Na ⁺鹽和NH ₄ ⁺鹽鈣指示劑是不滲透細(xì)胞的，可通過(guò)微量注射，貼片移液管或松果體細(xì)胞加載。

FLUO 8 ^®鈣指標(biāo)

FLUO-8 ^® AM地址的主要限制常見(jiàn)的基于FLUO染料，即要求小區(qū)負(fù)載的苛刻條件之一。需要加載傳統(tǒng)的基于Fluo的染料，例如Fluo- 2 AM（Cat No. 20495），F(xiàn)luo-3 AM（Cat No. 21013）和Fluo-4 AM（Cat No. 20550），并在37°C與細(xì)胞孵育長(zhǎng)達(dá)一個(gè)讀數(shù)可以采取前一小時(shí)，這不僅科目細(xì)胞苛刻的溫度下，也需要用戶花費(fèi)時(shí)間的加熱和冷卻細(xì)胞培養(yǎng)物。此外，它引入了溫育溫度為可能的混雜變量。FLUO-8 ^® AM通過(guò)提供可以在室溫下被加載到細(xì)胞中的魯棒鈣指示劑解決所有這些問(wèn)題。FLUO-8 ^®AM與其他基于氟的染料相比，對(duì)溫度的依賴性較小，因此可以在更寬的實(shí)驗(yàn)條件下獲得更一致的結(jié)果。此外，具有少至20分鐘的溫育時(shí)間，的Fluo-8 ^® AM能夠改善生產(chǎn)率快速周轉(zhuǎn)。好的部分是，即使結(jié)構(gòu)上的修改和改進(jìn)，F(xiàn)LUO-8 ^® AM的光譜特性保持不變，保持的Fluo-4 AM的熟悉光譜（即實(shí)施例/ EM = 494 / 517nm）。

在8的Fluo的好處^®系列

• 更快的細(xì)胞加載：8的Fluo ^®可以很容易地裝載到在室溫下的細(xì)胞。Fluo-3 AM和Fluo-4 AM需要37°C的加載溫度
• 亮的熒光：8的Fluo ^®是2倍亮度比的Fluo-4 AM，和比的Fluo-3AM明亮4倍
• 方便：8的Fluo ^®的相同光譜的那些的Fluo-4和的Fluo-3使升級(jí)容易的

學(xué)到更多：

• Fluo-3和Fluo-4鈣指標(biāo)

圖5.在HEK-293細(xì)胞中測(cè)出的卡巴膽堿劑量反應(yīng)。將Hek-293細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/ 100 µL /孔在Costar黑墻/透明底部96孔板中過(guò)夜接種。將細(xì)胞使用的Fluo-8用100μL的染料加載溶液中溫育^® AM（目錄號(hào)21083）或熒光4 AM（目錄號(hào)20550）在室溫下1小時(shí)。用NOVOstar（BMG Labtech）加入Carbachol（50μL/孔）達(dá)到指示的濃度。

FLUO 8 ^®鈣指示劑導(dǎo)向

下面列出規(guī)格表中為8的Fluo ^®鈣指示劑系列，它們的吸收率和發(fā)射大值，和它們的鈣離解常數(shù)。在8的Fluo附加的包裝規(guī)格^®鈣指示劑系列avaible，

1. 滲透性： AM酯鈣指示劑具有細(xì)胞滲透性，可以被動(dòng)加載到活細(xì)胞中（加載到細(xì)胞培養(yǎng)基中）。K ⁺鹽，Na ⁺鹽和NH ₄ ⁺鹽鈣指示劑是不滲透細(xì)胞的，可通過(guò)微量注射，貼片移液管或松果體細(xì)胞加載。

Fluo-3

Fluo-3是鈣指示劑，于1989年*推出，用于流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦激光掃描顯微鏡。熒光素樣化合物Fluo-3在沒(méi)有游離Ca ²⁺的情況下實(shí)際上是無(wú)熒光的。但是，與鈣結(jié)合后，F(xiàn)luo-3在525 nm處的發(fā)射強(qiáng)度會(huì)急劇增加。作為指示劑，F(xiàn)luo-3在細(xì)胞信號(hào)通路，肌細(xì)胞和神經(jīng)遞質(zhì)激活研究中至關(guān)重要。

Fluo-4

Fluo-4建立在Fluo-3的核心結(jié)構(gòu)上，但對(duì)其進(jìn)行了修改以提高熒光信號(hào)強(qiáng)度。化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致Fluo-4的大激發(fā)藍(lán)移，從506nm（Fluo-3）到494nm。實(shí)際上，這12 nm的偏移將Fluo-4的大激發(fā)光移至接近標(biāo)準(zhǔn)氬激光的波長(zhǎng)（即488 nm）。這會(huì)導(dǎo)致更好的激發(fā)，從而產(chǎn)生熒光信號(hào)，該信號(hào)明顯更亮并且對(duì)鈣濃度的變化更敏感。

圖6.將 U2OS細(xì)胞以40,000個(gè)細(xì)胞/ 100 µL /孔在96孔黑色壁/透明底部肋骨板上接種過(guò)夜。生長(zhǎng)培養(yǎng)基除去，將細(xì)胞用100μL的Fluo-3 AM的，的Fluo-4 AM和的Fluo-8孵育^®在4μM的在37℃，5％CO的濃度AM在HHBS ₂培養(yǎng)箱中1小時(shí)。細(xì)胞用200 µL HHBS洗滌兩次，然后使用FITC通道在熒光顯微鏡（Olympus IX71）上成像。

Fluo 3和Fluo 4鈣指示劑指南

下表列出了Fluo 3，F(xiàn)luo 4和Fluo 5鈣指示劑的規(guī)格，其吸收和發(fā)射大值以及其鈣解離常數(shù)。

1. 滲透性： AM酯鈣指示劑具有細(xì)胞滲透性，可以被動(dòng)加載到活細(xì)胞中（加載到細(xì)胞培養(yǎng)基中）。K ⁺鹽，Na ⁺鹽和NH ₄ ⁺鹽鈣指示劑是不滲透細(xì)胞的，可通過(guò)微量注射，貼片移液管或松果體細(xì)胞加載。

產(chǎn)品訂購(gòu)信息

非熒光鈣螯合劑，信號(hào)分子和測(cè)定試劑

傳統(tǒng)單波長(zhǎng)鈣指標(biāo)

比例鈣指標(biāo)

Calbryte™鈣指示劑

CAL-520 ^®鈣指示劑系列

Fluo- ^8®，F(xiàn)luo-5，F(xiàn)luo-4和Fluo-3鈣指示劑系列